Spektrofotometri


Spektrofotometri


Spektrofotometri
Kata Kunci: spektrofotometri

Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan  sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube.
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri.
Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda.
Absorbsi sinar oleh larutan mengikuti hukum Lambert-Beer, yaitu :

A =     log ( Io / It )         =  a b c
Keterangan  : Io = Intensitas sinar datang
It = Intensitas sinar yang diteruskan
a = Absorptivitas
b = Panjang sel/kuvet
c = konsentrasi (g/l)
A = Absorban
Spektrofotometri merupakan bagian dari fotometri dan dapat dibedakan dari filter fotometri sebagai berikut :
1. Daerah jangkauan spektrum
Filter fotometr hanya dapat digunakan untuk mengukur serapan sinar tampak (400-750 nm). Sedangkan spektrofotometer dapat mengukur serapan di daerah tampak, UV (200-380 nm) maupun IR (> 750 nm).
2. Sumber sinar
Sesuai dengan daerah jangkauan spektrumnya maka spektrofotometer menggunakan sumber sinar yang berbeda pada masing-masing daerah (sinar tampak, UV, IR). Sedangkan sumber sinar filter fotometer hanya untuk daerah tampak.
3. Monokromator
Filter fotometere menggunakan filter sebagai monokrmator. Tetapi pada spektro digunakan kisi atau prisma yang daya resolusinya lebih baik.
4. Detektor
-   Filter fotometer menggunakan detektor fotosel
-   Spektrofotometer menggunakan tabung penggandaan foton atau fototube.
Komponen utama dari spektrofotometer yaitu :
  1. 1. Sumber cahaya
Untuk radisi kontinue :
-         Untuk daerah UV dan daerah tampak :
-         Lampu wolfram (lampu pijar) menghasilkan spektrum kontiniu pada gelombang 320-2500 nm.
-         Lampu hidrogen atau deutrium (160-375 nm)
-         Lampu gas xenon (250-600 nm)
Untuk daerah IR
Ada tiga macam sumber sinar yang dapat digunakan :
-         Lampu Nerst,dibuat dari campuran zirkonium oxida (38%) Itrium oxida  (38%) dan erbiumoxida (3%)
-         Lampu globar dibuat dari silisium Carbida (SiC).
-         Lampu Nkrom terdiri dari pita nikel krom dengan panjang gelombang 0,4 – 20 nm
-      Spektrum radiasi garis UV atau tampak :
-       Lampu uap (lampu Natrium, Lampu Raksa)
-       Lampu katoda cekung/lampu katoda berongga
-       Lampu pembawa muatan dan elektroda (elektrodeless dhischarge lamp)
-       Laser
  1. 2. Pengatur Intensitas
Berfungsi untuk mengatur intensitas sinar yang dihasilkan oleh sumber cahaya agar sinar yang masuk tetap konstan.
  1. 3. Monokromator
Berfungsi untuk merubah sinar polikromatis menjadi sinar monokromatis sesuai yang dibutuhkan oleh pengukuran
Macam-macam monokromator :
-   Prisma
-   kaca untuk daerah sinar tampak
-   kuarsa untuk daerah UV
-   Rock salt (kristal garam) untuk daerah IR
-  Kisi difraksi
Keuntungan menggunakan kisi :
-   Dispersi sinar merata
-   Dispersi lebih baik dengan ukuran pendispersi yang sama
-   Dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spektrum
  1. 4. Kuvet
Pada pengukuran di daerah sinar tampak digunakan kuvet kaca dan daerah UV digunakan kuvet kuarsa serta kristal garam untuk daerah IR.
  1. 5. Detektor
Fungsinya untuk merubah sinar menjadi energi listrik yang sebanding dengan besaran yang dapat diukur.
Syarat-syarat ideal sebuah detektor :
-         Kepekan yang tinggi
-         Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi
-         Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.
-         Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.
-         Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.
Macam-macam detektor :
-    Detektor foto (Photo detector)
-      Photocell
-      Phototube
-      Hantaran foto
-      Dioda foto
-      Detektor panas
  1. 6. Penguat (amplifier)
Berfungsi untuk memperbesar arus yang dihasilkan oleh detektor agar dapat dibaca oleh indikator.
  1. 7. Indikator
Dapat berupa :
-         Recorder
-         Komputer

Pada artikel tempo hari telah dibahas tentang perbedaan antara spektrometri dan spektrofotometri, serta beberapa istilah yang sering digunakan dalam dunia spektrometri.

Kali ini akan dibahas mengenai jenis spektrofotometri dan perbedaannya. Spektrofotometri terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang digunakan. Diantaranya adalah sebagai berikut:

1. Spektrofotometri Vis (Visible)
2. Spektrofotometri UV (Ultra Violet)
3. Spektrofotometri UV-Vis
4. Spektrofotometri IR (Infra Red)


1. Spektrofotometri Visible (Spektro Vis)

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible).

Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.

Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilii warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible.

Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil.

Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein). Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin.

Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sample.


2. Spektrofotometri UV (ultraviolet)

Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium.

Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang berarti ‘dua’, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.

Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.

Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.

Sebagai contoh pada analisa protein terlarut (soluble protein). Jika menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu dibuat berwarna dengan reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample dapat langsung dianalisa.

Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample (Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar.

Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi sample. Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.


3. Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.

Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna.


4. Spektrofotometri IR (Infra Red)

Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 μm.

Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu gugus fungsi spesifik.

Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR terhadap panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan dibandingkan dengan signal standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk metode ini harus dalam bentuk murni. Karena bila tidak, gangguan dari gugus fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva yang diperoleh.

Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared Spectropgotometry (NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan pangan guna analisa bahan baku yang bersifat rutin dan cepat.

Monday, October 13, 2008

Ketika sedang browsing mencari journal dan artikel sebagai bahan referensi, saya kerap menemukan dua istilah yang awalnya saya anggap sama. Spektrometri dan spektrofotometri. Jika anda seorang chemist atau kerap bergelut dengan kimia, tentunya sudah tidak asing lagi dengan kata tersebut. Ya.. kata ini memang berhubungan dengan kimia analisis dan digunakan dalam analisa kualitatif atau kuantitatif.
Selama ini saya tidak memperhatikan alasan mengapa dalam menuliskan metode analisa, beberapa penulis dalam artikelnya ada yang menulis secara spektrometri, ada juga yang menulis secara spektrofotometri. Apakah dua istilah ini sinonim satu sama lain atau memiliki perbedaan? Apakah spektrofotometri hanya istilah lain untuk spektrometri?
Bagaimana dengan anda? Apakah anda biasa menuliskan metode spektrometri atau metode spektrofotometri, atau anda tidak begitu memperhatikan penggunaan istilah ini karena selama ini menganggap keduanya adalah sama?
Dalam bidang kimia analisis, sebetulnya ada beberapa istilah lain yang dekat dengan dunia spektrometri. Misalnya spektroskopi, spektrofotometri, kolorimetri, fotometri, spektrometer, dan lainnya. Dan kita-pun hampir setiap hari bersinggungan dan akrab dengan semua kata tersebut. Namun apa sih yang membedakan mereka?
Spektroskopi. Spektroskopi merupakan ilmu yang mempelajari interaksi antara radiasi dan benda sebagai fungsi panjang gelombang.Awalnya spektroskopi hanya mengacu pada pen-dispersi-an cahaya tampak berdasarkan panjang gelombang (misalnya oleh prisma). Untuk selanjutnya konsep ini berkembang untuk menunjuk pada segala bentuk pengukuran kuantitatif sebagai fungsi dari panjang gelombang dan frekuensi, tidak hanya meliputi cahaya tampak. Sehingga istilah ini bisa juga mengacu pada interaksi radiasi partikel atau respon terhadap berbagai range frekuensi. Jadi spektroskopi adalah istilah/nama yang digunakan untuk ilmu (secara teori) yang mempelajari tentang hubungan antara radiasi/energi/sinar (yang memiliki fungsi panjang gelombang, yang biasa di sebut frekuensi) dengan benda. Gabungan respon frekuensi ini disebut sebagai spektrum.
Spektrometri. Spektrometri adalah tehnik yang digunakan untuk mengukur jumlah (konsentrasi) suatu zat berdasarkan spektroskopi. Instrument yang digunakan disebut spektrometer. Jadi ada tiga istilah yang berbeda. Spektroskopi, spektrometri, dan spektrometer. Spektroskopi mengacu pada bidang keilmuan, spektrometri adalah tehnik aplikasi berdasarkan spektroskopi, sedangkan spektrometer adalah alat/instrument yang digunakan dalam tehnik spektrometri.
Beberapa macam metode analisa berdassarkan spektroskopi yang ada saat ini adalah:
Lantas bagaimana dengan spektrofotometri??
Tak jauh berbeda dengan spektrometri, spektrofotometri juga merupakan tehnik pengukuran jumlah zat yang juga berdasar spektroskopi. Hanya saja pada spektrofotometri, lebih spesifik untuk panjang gelombang UV(Ultraviolet)-dekat, visible, dan infra merah. Spektrofotometri dimasukkan ke dalam electromagnetik spectroscopy. Alat yang digunakan dalam spektrofotometri disebut spektrofotometer. Alat ini termasuk ke dalam jenis fotometer, suatu alat untuk mengukur intensitas cahaya. Spektrofotometer dapat mengukur intensitas sebagai fungsi dari warna, atau secara lebih khusus, fungsi panjang gelombang.
Sekarang sudah lebih jelas perbedaan antara spektrometri dan spektrofotometri. Itulah sebabnya untuk spektro UV/Vis disebut spektrofotometer UV-Vis, tidak Spektrometer Uv-Vis. Sebetulnya tidak salah juga menggunakan istilah spektrometer untuk Uv-Vis. Namun kurang tepat. kata spektrometer mengandung makna lebih luas ketimbang spektrofotometer.
Kemudian ada lagi yaitu kolorimetri. Kolorimetri adalah tehnik kuantifikasi berdasarkan perbedaan warna. Mirip dengan spektrofotometri, tapi spektra dipersempit hanya pada tristimulus values, dari mana persepsi warna terbentuk. Secara sederhana dapat diasumsikan bahwa kolorimetri adalah pengukuran konsentrasi berdasar perbedaan warna yang tampak oleh mata.

Prinsip Percobaan
Salah satu analisis untuk menentukan kadar suatu senyawa pada suatu sampel adalah dengan cara spektrofotometri. Spektrofotometri merupakan metode analisis yang didasarkan pada besarnya nilai absorbsi suatu zat terhadap radiasi sinar elektromagnetik. Prinsip kerja spektrofotometri adalah dengan menggunakan spektrofotometer yang pada umumnya terdiri dari unsur-unsur seperti sumber cahaya, monokromator, sel, fotosel, dan detektor. Sumber radiasi spektrofotometer dapat digunakan lampu deuterium untuk radiasi di daerah sinar ultraviolet sampai 350 nm, atau lampu filamen untuk sinar tampak sampai inframerah. Sinar yang dikeluarkan sumber radiasi merupakan sinar polikromatis, sehingga harus dibuat menjadi sinar monokromatis oleh monokromator. Radiasi yang melewati monokromator diteruskan ke zat yang akan diukur dan sebagian radiasinya akan diserap oleh zat tersebut. Zat yang  akan  diukur nilai  absorbannya diletakkan pada sel dengan wadah kuvet. Sinar yang diteruskan akan mencapai fotosel dan energi sinar diubah menjadi energi listrik (Khopkar 2003). Namun, nilai yang dihasilkan dari spektrofotometer bukanlah nilai absorban (A) melainkan  transmitan  (T). Oleh karena itu nilai  T  tersebut harus dikonversi ke dalam nilai A zatyang diukur. Konversi menggunakan rumus A= – log % T. Konversi ini dilakukan karena yang terukur adalah nilai transmitan (besarnya sinar radiasi yang melewati zat dan ditangkap detektor), sedangkan yang diinginkan adalah nilai absorban (besarnya sinar radiasi yang terserap oleh zat) dari zat yang diukur.
Penentuan nilai absorban pada percobaan kali ini adalah untuk mengetahui kadar asam amino pada sampel kentang. Penambahan ninhirin dan piridin sebagai pereaksinya, yang selanjutnya dilakukan pemanasan. Menurut Winarno (1997), asam amino merupakan unit pembangun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida pada setiap ujungnya. Pemanasan asam amino dengan ninhidrin akan memberikan kompleks berwarna ungu. Intensitas warna tersebut sebanding dengan konsentrasi asam amino bebas dalam pengukuran absorban pada panjang gelombang yang paling tepat. Asam amino lisin mempunyai rantai cabang yang dapat bermuatan positif maupun negatif, tergantung lingkungannya. Asam amino lisin juga mempunyai rantai cabang gugus basa.
Day dan Underwood (1986) menyatakan bahwa untuk mendeteksi asam amino dalam suatu larutan, maka sebelum larutan tersebut ditetesi piridin dan ninhidrin serta dipanaskan terlebih dahulu. Piridin berguna untuk menganalisis kadar H2O dalam suatu zat dan menggeser reaksi kearah kanan. Ninhidrin adalah suatu reagen untuk mendeteksi asam amino dan menetapkan konsentrasinya dalam larutan. Senyawa ini adalah hidrat dari triketon siklik dan apabila bereaksi dengan asam amino akan menghasilkan zat berwarna ungu. Panjang gelombang yang paling tepat untuk warna larutan tersebut adalah 625 nm.
Tujuan Percobaan
Tujuan dari percobaan kali ini adalah untuk mengetahui spektrum serapan maksimum suatu suatu zat pada panjang gelombang yang tepat dan menentukan kandungan asam amino bebas pada kentang dengan cara spektrofotometri.
Penentuan nilai absorban asam amino lisin dari nilai transmitan (T) yang diperoleh menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 625 nm (spektrum serapan maksimum), didapatkan hasil pada konsentrasi 10; 12; 14; 16; 18; 20; dan 22 ppm berurut-turut nilai absorbannya adalah 0,1739; 0,2161; 0,2248; 0,4023; 0,4486; 0,4976; dan 0,5719. Nilai absorban blanko (konsentrasi 0 ppm) sebesar 0,0035. Maka nilai absorban terkoreksi dari masing-masing konsentrasi antara 10-22 ppm tersebut, berturut-turut adalah 0,1704; 0,2126; 0,2213; 0,3988; 0,4451; 0,4941; dan 0,5684. Hasil tersebut kemudian dapat dibuat kurva hubungan antara konsentrasi asam amino lisin dengan nilai absorban terkoreksi (Gambar 2). Nilai persamaan linier (y=a+bx) dari kurva tersebut adalah y = -0,2072 + 0,0354x, dengan nilai sumbu y adalah absorban terkoreksi dan sumbu x adalah konsentrasi (ppm) asam amino lisin.
Analisis kadar asam amino dilakukan dengan mengujinya menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 625 nm (spektrum serapan maksimum) juga. Ulangan 1 sampai ulangan 4 didapatkan nilai absorban berturut turut 0,3010; 0,2857; 0,3045; dan 0,2958. Sehingga dengan nilai absorban blanko 0,0035, maka nilai absorban terkoreksi dari keempat ulangan adalah 0,2975; 0,2822; 0,3010; dan 0,2923. Keempat data ulangan tersebut menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang nyata pada nilai absorban terkoreksinya, nilainya berkisar antara 0,2822 – 0,3010. Dari data tersebut didapatkan nilai konsentrasi sampel berturut-turut dari ulangan 1 sampai 4 adalah 356,4265; 345,6214; 358,8983; dan 352,7542 ppm. Dapat dilihat bahwa konsentrasi sampel berkisar antara 345,6214 – 358,8983 ppm.
Alasan kenapa harus menggunakan panjang gelombang yang tepat dalam penentuan nilai absorban, adalah karena apabila pengujian dilakukan pada panjang gelombang yang tidak tepat berakibat tidak validnya data pengujian. Ketika terjadi perubahan konsentrasi yang besar, nilai absorbannya hanya sedikit berubah. Namun jika diuji dengan panjang gelombang yang tepat (spektrum serapan maksimum) maka apabila terjadi perubahan konsentrasi zat sedikit saja, maka akan terjadi perubahan nilai absorban yang cukup besar. Penentuan panjang gelombang yang tepat (spektrum serapan maksimum), salah satunya dilakukan dengan cara menguji nilai transmitan pada spektrofotometer antara panjang gelombang 400-700 nm dengan interval 5 nm.
Simpulan
Penentuan kadar asam amino dapat dilakukan dengan metode spektrofotometri pada panjang gelombang yang tepat (spektrum serapan maksimum) yaitu 625 nm. Nilai absorban asam amino lisin meningkat berbanding lurus dengan meningkatnya konsentrasi asam amino tersebut dalam larutan. Konsentrasi asam amino kentang dengan empat ulangan berkisar antara 345,6214 – 358,8983 ppm.
Daftar Pustaka
Day RA dan Underwood AL.1986. Analisis Kimia Kuantitatif edisi Kelima. Jakarta: Erlangga.
Khopkar SM. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press.
Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia.

Share it

Amazon MP3 Clips